Biosensori amperometrici bazati pe geluri de alginat si polipirol-alginat continÂnd celule algale de chlorella vulgaris

Biosensori amperometrici bazati pe geluri de alginat si polipirol-alginat continând celule algale de Chlorella vulgaris

1. Introducere

Cum a fost mentionat in modulul 10, alginatul face parte din familia de polizaharide liniare ce contine cantitati variate de reziduuri de acid β-D-manuronic si reziduuri de acid α-L-guluronic. Aceste reziduuri pot varia mult ca procent formând aranjamente compacte de-a lungul lantului polizaharidic. Cationii divalenti sunt legati de partile de acid guluronic într-o maniera cooperativa sporita, iar marimea unitatilor cooperative este mai mare de 20 de monomeri [222].

Alga verde eucariota Chlorella vulgaris este frecvent utilizata pentru studii de imobilizare si îndepartarea nutrientilor [223, 224] Celule de C. vulagaris sunt foarte abundente în natura si sunt de importanta majora pentru ecosistemul acvatic, fiind considerate bioindicatori naturali ale bioactivitatii reziduurilor industriale. Analiza microscopica a acestor celule, evidentiaza o forma sferica, de 5-l0 mm în diametru. În domeniul biosensorilor, celulele de C. vulgaris au fost deja utilizate în construirea de biosensori optici si electrochimici [225, 226].

În acest modul se descriu avantajele aduse în construirea biosensorilor amperometrici de catre noua molecula sintetizata de pirol-alginat (modulul 10) în atie cu cea a alginatului natural pentru imobilizarea de celule algale de C. Vulgaris [82]].

2. Prepararea biosensorului algal

La temperatura camerei (25°C) au fost amestecate viguros 5 ml de suspensie celule algale cu 10 ml alginat (2%, w/v) sau pirol-alginat (2%, w/v). Cele doua amestecuri apoase diferite au fost depozitate pe suprafata electrodului de platina (20 µl) si acoperiti cu o picatura de clorura de calciu (0.1 M) pentru 5 minute. Electrodul modificat cu pirol-alginat a fost ulterior electropolimerizat la temperatura camerei prin controlarea potentialului de oxidare la 0.94V pentru 10 minute într-o solutie apoasa continând 0.1 M LiClO₄.

3. Compararea electrochimicǎ a stabilitǎtii gelurilor de alginat si poli-pirol alginat ce contin celule algale

Permeabilitatea ferocenului dicarboxilic (2 mM) dizolvat în tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH 9) continând 1 mM MgCl₂ a fost investigatǎ pentru cele douǎ tipuri de geluri, ilustrând astfel oxidarea unui electron la suprafata electrodului. ura 1A,B prezintǎ voltamogramele ciclice obtinute pentru electrodul nemodificat si modificat cu poli(pirol-alginat-celule algale) la temperatura de 30°C.

Prezenta gelului de APPyA conduce la o scǎdere marcantǎ în intensitatea reversibilitǎtii picului de ferocen, unde valoarea curentului anodic scade de la 130 la 58 µA. Dupǎ incubarea acestui electrod modificat în tamponul agitat magnetic (300 rpm) la 30°C pentru 50 de minute, se observǎ o crestere a curentului anodic pânǎ la 68 µA (ura 1C). Acestǎ crestere minorǎ de curent demonstreazǎ stabilitatea bunǎ a gelului de

ura 1. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) pentru (A) un electrod de platinǎ nemodificat la 30°C; B) un electrod de Pt modificat cu un gel de poli(pirol-alginat) contiâind celule algale - etapa intialǎ; C) acelasi electrod (B) folosit dupǎ 50 de minute într-o solutie dimamicǎ tampon. Potentialul de scanare a fost între 0 si 0.7 V fatǎ de Ag/AgCl în 0.1M Tris-HCl (pH 9) continând 1 mM MgCl₂ la 30°C. Viteza de scanare a fost de 0.1 V s^-l.

APPyA la suprafata electrodului de platinǎ la 30°C.

Cum s-a presupus, depozitul de alginat-celule algale (AA) induce initial aceleasi impiedicǎri sterice ca APPyA în ceea ce priveste accesul speciei redox, efect ilustrat prin valoare de curent anodic de 60 µA (ura 2A). Din contrǎ, se observǎ o crestere a curentului anodic pânǎ la 120 µA dupǎ imersarea în solutia de tampon termostatǎ la 30°C, indicând astfel pierderea aproape totalǎ a depozitului de alginat în solutie (ura 2B). Deoarece stabilitatea gelului de alginat a fost influentatǎ de temperatura de 50°C, s-au efectuat experiente similare cu gelul de AA la temperaturi scǎzute de 10°C si 15°C. Din rezultatele obtinute se observǎ o crestere a curentului anodic de la 60 mA la 100 mA si respectiv 105 µA (ura 2C, D). Desi cresterea temperaturii sporeste instabilitatea gelului de AA, la temperaturi scǎzute de asemenea AA este instabil la suprafata electrodului de platinǎ.

ura 2. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) în solutia tampon 0.1 M Tris-HCl (pH 9) + 1 mM MgCl₂ pentru un A) electrod de platinǎ (Pt) modificat cu gel de alginat continând celule algale (faza initialǎ); B) acelasi electrod modificat dupǎ 50 de minute de agitare într-o solutie tampon termostatǎ la 30°C. C) acelasi AA electrod dupǎ 50 de minute într-o solutie dinamicǎ, termostatǎ la 10°C; D) acelasi AA electrod dupǎ 50 de minute într-o solutie termostatǎ la 15°C. Potentialul de scanare a fost cuprins între 0 si 0.7 V fatǎ de Ag/AgCl; viteza de scanare a fost de 0.1 V s^-l.

4. Performantele analitice ale biosensorilor celule algale-alginat si celule algale-pilipirol-alginat

Performantele analitice ale celor douǎ tipuri de biosensori-algali pentru determinarea pNPP au fost ate în conditii de pH optim de 9 si la o temperaturǎ optimǎ de 20°C. Sensibilitatea si rǎspunsul biosensorului celule algale-polipirol alginat au fost de 2 mAM^-l cm² si de 15s, iar pentru biosensorul celule algale-alginat au fost de 4 mAM^-l cm² si de 5s. Aceste rezultate evidentiazǎ o sensibilitate si un rǎspunsul rapid al biosensorului celule algale-alginat mult superioare în atie cu cele ale biosensorul celule algale-polipirol alginat ca urmare a unei porozitǎti mai bune a gelului nemodificat de alginat ce faciliteazǎ cresterea proprietǎtilor de difuzie fatǎ de reteaua de polipirol-alginat.

Cum a fost descris în experimentele de voltametrie ciclicǎ, reteaua de polipirol afecteazǎ profund accesul speciilor electroactive la suprafata electrodului.

Stabilitatea operationalǎ a celor douǎ tipuri de biosensori algali a fost studiatǎ prin înregistrarea continuǎ a rǎspunsului de curent maxim (I_max) obtinut în prezenta a 1mM pNPP dispersat în solutia agitatǎ magnetic de 0.1 M Tris-HCl (pH 9, 20°C) în functie de timp. Rǎspunsul biosensorului a fost stabil pentru 20 si 120 minute pentru gelul de AA si respectiv APPyA

Stabilitatea de stocare a biosensorilor-AA si APPyA la 4°C a fost investigatǎ în solutie de tampon 0.1 M Tris-HCl (pH 9) continând 1 mM MgCl₂. Pentru acesta au fost înregistrate rǎspunsurile de curent caracteristice biosensorilor în prezenta concentratiilor crescǎtoare de pNPP. Mai mult, se observǎ cum sensibilitatea biosensorului bazat pe gelul de APPyA scade la 65% din valoarea initialǎ a curentului dupǎ 10 zile, în timp ce a fost total distrusǎ sensibilitatea bio-sensorului-AA.

Concluzii

În acest modul este prezentatǎ elaborarea reusitǎ a biosensorilor amperometrici cu celule algale de Chlorella vulgaris incapsulate fie într-un gel natural de alginat, fie într-un gel sintetic de alginat ce contine grupǎri de pirol grefate.

Studiul ativ al celor douǎ geluri de alginat ilustreazǎ prin intermediul activitǎtii fosfatazei alcaline a celulelor algale incapsulate, rolul benefic jucat de polimerizarea electrochimicǎ a retelei de polipirol în interiorul gelului de alginat. Acestǎ retea sporeste stabilitatea mecanicǎ a gelului în prezenta temperaturilor ridicate (30°C) si a convectiei.