ACTIUNEA AGENTILOR FIZICI, CHIMICI SI BIOLOGICI

ASUPRA BACTERIILOR

DEFINIREA TERMENILOR

Pentru intelegerea mai clara a actiunii unor agenti fizici si chimici asupra bacteriilor, se impune mai intai definirea unor notiuni.

Un agent bacteriostatic este acela care are proprietatea de a stopa multiplicarea bacteriilor. Multiplicarea reapare dupa indepartarea agentului respectiv.

Un agent bactericid are proprietatea de a omori (inactiva definitiv) celula bacteriana, procesul fiind ireversibil: chiar dupa indepartarea agentului, nu se mai produce multiplicarea bacteriana. In acest caz, este vorba de liza celulei bacteriene sau, mai rar, de pastrarea intacta a morfologiei celulare, dar cu oprirea functiilor cardinale ale celulei.

Sterilizarea reprezinta actiunea prin care se obtine suprimarea oricarei flore microbacteriene.

Dezinfectantul este o substanta (agent) folosita pentru inactivarea microorganismelor de pe unele suprafete (mese, podele), dar care, datorita toxicitatii sale marcate, nu poate fi aplicat in tesuturi umane.

Dezinfectia este procesul de inactivare a microorganismelor de pe suprafete (obiecte neanimate).

Antisepsia consta in aplicarea unor substante bactericide sau bacteriostatice in scopul de a omori sau inhiba dezvoltarea florei patogene in plagi.

Asepsia cuprinde toate masurile care impiedica contaminarea cu agenti infectiosi a unei plagi.

Conservarea reprezinta prevenirea alterarii prin agenti microbieni ai unor produse degradabile cum sunt alimentele sau medicamentele.

ACTIUNEA AGENTILOR FIZICI ASUPRA BACTERIILOR

Dintre cei mai imoprtanti agenti fizici care pot influenta viabilitatea si puterea de multiplicare a bacteriilor, mentionam: caldura, uscaciunea, (desicarea), presiunea mecanica si osmotica, radiatiile, electricitatea etc.

1. CALDURA

Temperaturile ridicate (caldura) prezinta in general (cu exceptia grupului restrans al bacteriilor termofile) o actiune bactericida. Temperaturile joase sunt mai putin nocive, cele mai multe specii bacteriene rezistand un timp in stare latenta, fara multiplicare (hibernare bacteriana). In functie de temperatura optima de dezvoltare, bacteriile se impart in: mezofile (37⁰C); criofile sau psihrofile (25-30⁰C sau mai putin); termofile (55-65⁰C).

Caldura actioneaza diferentiat asupra formelor vegetative si, respectiv, asupra sporilor bacterieni. Astfel, asupra formelor vegetative, temperatura de 100⁰C, realizeaza un efect bactericid complet in 2-3 minute, pe cand sporii rezista chiar 15 minute la temperatura de 120⁰C. Trebuie precizat faptul ca exista o corelatie temperatura-timp, in ceea ce priveste efectul sterilizant.

Rezistenta la actiunea caldurii a diferitelor specii bacteriene este variabila si anume:

a.      Forme vegetative (exemplu: Mycobacterium tuberculosis).

b. Spori. In ceea ce priveste timpul de distructie prin caldura, se pot descrie urmatoarele diferente de specie:

In tabelul de mai jos redam corelatia intre timpul de distructie prin caldura uscata si temperatura, pentru diferitele specii bacteriene aflate in forma sporulata:

Pentru a aprecia eficienta sterilizarii prin caldura, se folosesc urmatorii parametrii:

- timp de moarte termica: reprezinta cel mai scurt interval de timp necesar inactivarii unei suspensii bacteriene la o anumita temperatura si in anumite conditii.

- timp de reducere decimala (valoarea D): reprezinta intervalul de timp (in minute) necesar reducerii numarului de celule vii cu 90% din valoarea initiala (cu 9 log ₁₀ ).

1.1. STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA

Caldura uscata omoara microorganismele prin oxidarea distructiva a componentelor celulare. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi de caldura uscata la 160⁰C, timp de 60 minute. Caldura uscata de 100⁰C distruge in 60 de minute bacteriile care sunt omorate prin caldura umeda la 60⁰C in 30 minute. Sporii fungilor sunt distrusi in 60 de minute la 115⁰C, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse intre 120-l60⁰C. In laboratorul de microbiologie se utilizeaza urmatoarele tehnici de sterilizare: incalzirea la rosu, flambarea, sterilizarea la pupinel si sterilizarea cu raze infrarosii.

- Incalzirea la rosu in flacara a obiectelor se aplica anselor bacteriologice in laboratorul de microbiologie.

- Flambarea (trecerea prin flacara pentru cateva secunde) se aplica gatului baloanelor, eprubetelor dupa deschidere si inainte de inchiderea lor, pipetelor inainte de utilizare pentru a preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizeaza prin flambare instrumente de mica chirurgie, dupa ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsa nu este suficient de inalta pentru a asigura o sterilizare optima.

- Sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalica cu pereti dubli intre care se gaseste un strat de azbest care impiedica pierderile de caldura. Mai este prevazut cu o sursa de caldura care este energia electrica si un termoregulator. In interior pupinelul este prevazut cu rafturi pentru obiectele de sterilizat. Temperatura de sterilizare la pupinel este de 160⁰C timp de 1 ora sau de 180⁰C timp de de ora. La pupinel se sterilizeaza intreaga sticlarie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fara armatura metalica, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie sa fie supraincarcat, pentru ca aerul sa poata circula nestingherit printre obiectele de sterilizat.

- Sterilizare cu raze infrarosii este folosita pentru sterilizarea seringilor fara armatura metalica la o temperatura de 180⁰C. Sterilizarea se poate efectua si la 200⁰C in vid, aplicandu-se instrumentelor chirurgicale.

1.2. STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA

Caldura umeda este mai eficienta decat caldura uscata, distrugand bacteriile la o temperatura mai scazuta si in timp mai scurt. Formele vegetative ale majoritatii bacteriilor, fungilor si virusurilor animale sunt omorate de caldura umeda in 10 minute la temperaturi cuprinse intre 50⁰C (Neisseria gonorrhoeae) si 65⁰C (Staphilococcus aureus). O susceptibilitate deosebita fata de caldura o prezinta Treponema pallidum, care este distrusa in 10 minute la 43⁰C. Rezistenta maxima la caldura umeda o are, insa, Bacillus stearothermophylus, a carui forma vegetativa se poate multiplica la 80⁰C. O parte din virusurile animale au o rezistenta crescuta fata de caldura umeda, ca, de pilda, virusul poliomielitic care este inactivat la 60⁰C dupa 30 de minute si virusul hepatitei B care, daca se afla in ser, rezista 10 ore la 60⁰C. Multi bacteriofagi au o rezistenta mai mare la caldura umeda decat bacteria gazda, aceasta fiind distrusa la 60⁰C in 15-30 de minute, iar bacteriofagul la temperaturi cuprinse intre 65-80⁰C.

Formele sporulate ale actinomicetelor, ciupercilor si a fungilor sunt mai rezistente decat formele vegetative, dar nu atat de rezistente ca si sporii bacterieni.

Rezistenta sporilor bacterieni variaza la diferite specii, dar chiar si intre tulpinile aceleiasi specii. Astfel, majoritatea sporilor de Cl. tetani sunt distrusi prin fierbere la 100⁰C in 10 minute, dar s-au semnalat tulpini ai caror spori rezista la fiebere 1-3 ore, fiind cei mai rezistenti patogeni ce pot infecta o plaga. Rezistenta lor determina standardele minime pentru sterilizarea chirurgicala: 10 minute la 121⁰C sau 30 de minute la 115⁰C fara a socoti timpul de incalzire. Unii spori de Cl. botulinum rezista la fierbere la un pH de 7 pana la 8 ore, iar la autoclavare 10-40 minute la 115⁰C.

Omorarea microorganismelor prin caldura umeda se produce prin coagularea proteinelor structurale si inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi prin expunere la caldura umeda la 121⁰C timp de 30 de minute.

- Fierberea este de fapt o metoda de dezinfectie deoarece ea nu distruge toate formele sporulate. Se efectueaza la 100⁰C timp de de ora si se aplica siringilor si instrumentelor de mica chirurgie atunci cand nu este posibila alta metoda. Fierberea se mai foloseste in epidemii la sterilizarea apei.

- Pasteurizarea a fost introdusa de Pasteur pentru conservarea vinului, fiind utilizata si acum pentru sterilizarea unor alimente lichide care nu suporta temperaturi prea ridicate (lapte, bere, sucuri de fructe). Metoda consta in incalzirea lichidului: la 62⁰C pentru 30 de minute (pasteurizare joasa), la 71⁰C timp de 15 minute (pasteurizare medie), la 80-85⁰C timp de 3-5 minute (pasteurizare inalta ) sau introducerea unor vapori filanti la o temperatura de 130-l50⁰C sub presiune pentru cateva secunde (ultrapasteurizare). Pasteurizarea este o metoda eficienta deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta in lapte (Mycobacteium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus si Brucella) nu sunt bacterii sporulate, numarul lor reducandu-se dupa pasteurizare cu 97-99%. Coxiella burnetii nu este distrusa prin pasteurizare joasa.

- Tyndalizarea consta in incalzirea produsului de sterilizat 3 zile la rand, in baie de apa la 56-l00⁰C cate o ora. Temperatura se alege in functie de produsul de sterilizat. Metoda se aplica lichidelor care nu suporta temperaturi ridicate, ca de exemplu: vaccinuri, medii de cultura ce contin zaharuri in concentratie mare, proteine, gelatina etc. Formele vegetative sunt distruse in prima zi, iar sporii se transforma in forme vegetative ce vor fi distruse zilele urmatoare. Reamintim, insa, ca sporii bacteriilor termofile nu se distrug prin aceasta metoda.

- Autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar in laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc intr-o atmosfera saturata de vapori de apa la 120⁰C, la o presiune de 1 atm, timp de 30 de minute, in aparate speciale numite autoclave.

2. USCACIUNEA (DESICAREA)

Sensibilitatea bacteriilor la uscaciune este diferita, in functie de specie si chiar tulpina. In general, bacteriile sunt rezistente la uscaciune in forma sporulata si, pentru unele specii, chiar in forma vegetativa (Mycobacterium tuberculosis persista in picaturi de sputa uscata si la intuneric).

Rezistenta relativa a bacteriilor la uscaciune, precum si la temperaturile scazute, a stat la baza punerii la punct a uneia dintre cele mai folosite metode pentru conservarea microorganismelor.

Liofilizarea. Este vorba de uscarea (desicarea) treptata in vid, la temperaturi foarte joase (-40⁰C pana la -70⁰C). In stare liofilizata, bacteriile pot fi conservate la temperatura camerei mult timp (ani).

3. PRESIUNEA MECANICA

Majoritatea bacteriilor rezista la presiuni foarte mari (3.000 atm, formele vegetative; 12.000-20.000 atm, formele sporulate).

4. PRESIUNEA OSMOTICA

Bariera osmotica a celulei bacteriene este membrana citoplasmatica. In mediu hiperton (cu concentratie inalta de ioni si macromolecule organice) are loc procesul de plasmoliza: apa din celula iese in mediu, citoplasma se retracta, odata cu membrana citoplasmatica, in timp ce peretele celular, rigid, nu-si modifica forma. In mediu hipoton (cu concentratie scazuta de ioni si molecule organice) se produce fenomenul invers, de plasmoptiza: patrunderea apei in celula bacteriana, care devine turgescenta, procesul evoluand pana la liza celulara (mai ales daca, in prealabil, peretele celular, rigid si rezistent, a fost indepartat prin lizozim -protoplasti- sau prin antibiotice inhibitorii ale sintezei acesteia -sferoplasti).

5. RADIATIILE

Radiatiile se pot clasifica in: radiatii ionizante (X, g, catodice) si in radiatii ultraviolete.

5.1. RADIATIILE IONIZANTE

Categoriile de radiatii ionizante sunt urmatoarele:

Radiatiile X sunt produse de generatoare speciale; au lungimea de unda l=0,1nm-40nm.

Radiatiile g sunt produse de izotopi (cobalt 60); au lungimea de unda l=0,1nm-l0nm.

Radiatiile catodice sunt produse in dispozitive speciale, numite acceleratori de electroni; sunt compuse dintr-un flux de electroni cu viteza foarte mare (accelerati); puterea lor de penetrare este de peste 1x10⁶ volti.

Radiatiile ionizante au ca mecanisme de actiune denaturarea proteinelor, acizilor nucleici celulari si formarea de radicali liberi si peroxizi.

Denaturarea proteinelor si acizilor nucleici celulari se realizeaza prin puterea mare de penetrare a acestor radiatii cu dezintegrarea structurilor primare, secundare si tertiare ale proteinelor (mai ales la nivelul gruparilor polare), cu ruperea lanturilor acizilor nucleici (ARN monocaternar prezinta sanse de refacere, pe cand, ADN bicatenar sufera o degradare definitiva).

Efectul de ionizare se realizeaza prin formarea de radicali liberi (OH si H₂O) in apa mediului, prin flux fotonic cu energie inalta cu efect letal si formarea de peroxizi (R-O-O-R), ce actioneaza ca agenti oxidanti.

5.2. RADIATIILE ULTRAVIOLETE

Radiatiile ultraviolete prezinta o lungime de unda l=40nm-390nm, iar activitatea lor bacteriana maxima este de 260nm. Aceste radiatii se absorb selectiv la nivelul acizilor nucleici, indeosebi ADN, determinand formarea dimerilor pirimidinici toxici Modificarile induse in celulele bacteriene prin razele ultraviolete sunt reversibile, prin procesele de fotoreactivare si restaurare la intuneric.

Fotoreactivarea: radiatiile luminoase pot activa o enzima celulara care cliveaza dimerii pirimidinici toxici.

Restaurarea la intuneric (dark repair) consta in faptul ca, la intuneric, are loc actiunea succesiva a trei enzime (o endonucleaza - care desprinde dimerul pirimidinic de pe ADN; o exonucleaza - care formeaza lacune de-a lungul moleculei alterate de ADN, prin clivare secventiala; o ADN-polimeraza - care umple lacunele, folosind ca matrice portiunea omologa din lantul geaman de ADN, nealterat. Prin fotoreactivare si restaurare la intuneric, se selecteaza indivizi bacterieni rezistenti la efectul radiatiilor.

Aplicatiile radiatiilor ultraviolete in laboratorul de microbiologie se refera in principal la folosirea lor ca agenti sterilizanti. Astfel, radiatiile ultraviolete se utilizeaza pentru sterilizarea incaperilor, boxelor, hotelor, salilor de operatii, meselor de laborator, etc.

6. ULTRASUNETELE

Ultrasunetele reprezinta vibratii cu frecventa mai mare decat cea a undelor sonore (peste 16.000 hertzi). Ele se obtin cu ajutorul cristalelor piezoelectrice. Ultrasunetele au un puternic efect bactericid, producand relativ rapid distructia celulei bacteriene. De altfel, una dintre cele mai eficiente metode de dezintegrare a corpilor microbieni - etapa preliminara analizei chimice a bacteriilor in laborator - este ultrasonarea suspensiei bacteriene.

7. ELECTRICITATEA

Curentul electric, ca atare, exercita actiuni minore asupra bacteriilor. In schimb, el poate influenta compozitia fizico-chimica a mediului, cu efecte secundare bactericide: cresterea temperaturii peste valorile optime desfasurarii normale a metabolismului bacterian; ionizarea clorului din compusii clorurati; formarea de ozon.

8. FILTRAREA

Sterilizarea anumitor lichide care contin substante alterabile prin caldura, se face cu ajutorul filtrelor. Lichidele termolabile sunt trecute prin filtre sterilizante, care retin microorganismele, permitand trecerea lichidului astfel sterilizat.

Filtrele folosite sunt de mai multe feluri, in functie de compozitie:

- filtre Chamberlan din portelan, numite si bujii, in forma de lumanare;

- filtre Berkefeld din pamant de infuzorii (Kisselgur), putand fi reconditionate dupa folosire;

- filtre Seitz din placa de azbest si celuloza; dupa dimensiunea porilor, pot fi: clarifiante (cu pori mari) sau sterilizante (cu pori de dimensiuni foarte reduse) - EKS₁, EKS₂;

- filtre de metilen celuloza (Millipore, Sartorius), ce prezinta o porozitate de 0,2 microni.